Криминалистическая биоинформатика: как пыльца, грибы и микробы помогают раскрывать преступления

В 1969 году под Веной во время сплава по Дунаю пропал человек. Следователи арестовали подозреваемого, у которого был мотив для убийства, но не могли добыть доказательств его вины — пока не отправили образец грязи с его ботинок специалисту по пыльце (палинологу). Тот нашёл в образце пыльцу ивы, ели, ольхи, а также давно вымершего в Европе дерева гикори. По словам эксперта, такой букет — так называемый пыльцевой спектр — можно было собрать только в одном месте Австрии: в небольшом регионе в 20 километрах к северу от Вены, где обнажались отложения миоценового периода — оттуда и вымыло окаменевшую пыльцу гикори, — и где рос елово-ольхово-ивовый лес. Узнав, что криминалисты могут скоро раскрыть преступление, подозреваемый сознался и показал место, где было спрятано тело [1].

Почему пыльца удобна для геолокации

Пыльца незаметна и крайне устойчива. Ни 20 миллионов лет, ни стирка с отбеливателем не избавят вашу одежду от её следов полностью: спорополленин, покрывающий пыльцевое зерно, — одна из самых химически стабильных органических субстанций, а из-за малых размеров (в среднем 20–60 микрометров) и выростов на поверхности пыльца надёжно запутывается в волокнах ткани.

Пыльцевые зёрна ещё и уникальны. По их внешнему виду можно определить, каким растениям они принадлежат — значит, можно выяснить и регион происхождения образца. Это помогает отследить трафик наркотиков и ввоз санкционных товаров или доказать, что бабочка-репейница, которую вы встретили на побережье Испании, зимовала в Африке и побывала в Сахаре [2]. Даже в пределах одной природной зоны растительные сообщества сильно различаются: в лесу, городском парке и в пойме реки пыльцевые спектры будут разными.

Но определить видовую принадлежность растения, глядя на пыльцу, не так просто. Раньше это мог сделать только специалист-палинолог. Сейчас появились системы автоматической классификации по микрофотографиям (например, PIGLT [3]), и уже не обязательно искать эксперта и пересылать ему образцы в конверте; но фотографии делать всё же придется, а это тоже дело долгое и трудоёмкое. Есть и другая проблема: часто по внешним признакам пыльцы в принципе невозможно определить растение с точностью до вида. А хотелось бы! Ведь чем точнее классификация, тем более узок регион поиска.

Рисунок 1. Пыльца ивы козьей (Salix caprea, A), ольхи чёрной (Alnus glutinosa, B), ели обыкновенной (Picea abies, C) и сирени обыкновенной (Syringa vulgaris, D) [4–7]

Как определить вид растения (и не только) с помощью ДНК

К счастью, теперь видовую принадлежность можно определить с помощью секвенирования ДНК. Больше того, не пыльцой единой покрыты вещи: обломки сухих листьев, одинаковые на вид гифы грибов, бактерии, — человеку, вооружённому секвенатором, каждая букашка может помочь в поиске. Чтобы определить вид образца, прицельно прочитывают небольшой максимально информативный фрагмент его генома, так называемый баркод, а затем сравнивают его с известными баркодами из базы данных.

Фрагменты, способные сыграть роль баркодов, исследователи выбирали не один год. Подходящих кандидатов не так много: одной стороны, такой участок должен присутствовать у всех организмов выбранной таксономической группы (например, у всех растений), то есть быть достаточно важным, чтобы от него нельзя было избавиться в ходе эволюции, а с другой — он должен различаться даже у близкородственных видов. Для этого ему нужно заниматься тем, чего важные участки обычно избегают: активно накапливать мутации. Кроме того, участок должен легко копироваться методом ПЦР (полимеразной цепной реакции), а для этого окружающие его последовательности, наоборот, должны быть очень похожи у всех организмов группы. Сам же он должен быть коротким, не более 1000 нуклеотидов.

На самом деле требований больше, и одного фрагмента не всегда достаточно для точного определения вида, поэтому в качестве баркода могут использовать последовательности двух или трёх фрагментов. У бактерий и архей обычно секвенируют ген, кодирующий часть рибосомы — ген 16S рРНК, а у эукариот — фрагменты геномов митохондрий или пластид: они накапливают больше замен, у них менее запутанное наследование, чем у ядерной ДНК, а ещё они присутствуют в клетке во множестве копий — значит, выделять и секвенировать их проще. Это особенно важно, если жизнь потрепала образец, и часть ДНК успела деградировать.

Известные последовательности баркодов можно найти, например, в библиотеке проекта BOLD (Barcode of Life Data System). Это самая крупная из подобных баз данных: к апрелю 2024 года она содержала баркоды для 365 тысяч видов живых организмов. Есть и более специализированные проекты: например, библиотека GreenGenes содержит баркоды для бактерий, а Diat.barcode — для коллекции диатомовых водорослей (это ещё один любимый класс растений у криминалистов — они тоже микроскопические, космически разнообразные по форме и покрыты панцирем из диоксида кремния). Баркодирование, конечно, применяют не только криминалисты: с его помощью идентифицируют патогены, находят новые виды, следят за биоразнообразием и состоянием экосистем, проверяют составы продуктов и растительных препаратов, так что библиотеки баркодов собираются совместными усилиями разных специалистов.

Можно ли верить «показаниям» пыльцы и грибов

Чем больше разных видов организмов обнаруживается в образце, тем сильнее в среднем сужается регион поиска. К счастью, технологии NGS (next generation sequencing) позволяют считывать баркоды буквально из грязи, получая информацию о видовой принадлежности всей водорослевой, например, или бактериальной ДНК. Такую совокупную ДНК называют метагеномом, а подход — метабаркодированием. В криминалистике он пока применяется не очень активно, но предварительные исследования вдохновляют: с помощью алгоритма машинного обучения Random Forest по бактериальному метагеному свежих следов можно определить, где гулял любитель тащить грязь в дом [8], а по составу кишечной микробиоты жителей Китая — прикинуть, на какой широте они живут [9].

Недавно китайские криминалисты применили метабаркодирование, чтобы опознать тело женщины [10]. В местных списках пропавших её не было; поиск по ДНК, по отпечаткам пальцев и другим приметам тоже ничего не дал. Тогда криминалисты заглянули к ней в лёгкие. Дело в том, что небольшая часть пыльцевых зёрен, попавших в дыхательные пути, остаётся в них навсегда, так что человек, долгое время проживший в одном районе, оказывается «помечен» пыльцой окрестных растений. Сопоставив образцы, полученные из лёгких, с географическим распределением флоры Китая, криминалисты смогли сузить поиски до двух провинций — и в итоге женщину удалось найти в списках пропавших в одной из них.

Насколько же точен этот метод? Чтобы проверить, авторы одного из исследований собрали в четырёх разных точках США 42 пробы пыли и попытались с помощью метабаркодирования восстановить регион её происхождения. Для этого карту США разбили на ячейки площадью 250 квадратных километров, и для каждой ячейки подсчитали, какой процент таксонов из тех, что обнаружены в пробе пыли, встречается на этой территории. Для каждой пробы получилась вот такая карта (Рисунок 2).

Рисунок 2. Результаты геолокации по пыльце. Стрелкой указана настоящая локация образца [11]

В «правильной» ячейке процент таксонов почти всегда был максимальным, но похожих ячеек оказалось много, так что точность геолокации получилась невысокой — около 600 км [11]. Информацию о том, где что растёт, авторы брали из базы данных проекта BISON, который каталогизирует флору и фауну Соединённых Штатов. Точность результата зависела как от времени сбора образцов, так и от региона: зимние образцы содержали пыльцу меньшего числа видов и потому хуже поддавались геолокации; разрешение метода также было ниже там, где большие пространства заняты относительно гомогенной флорой.

Исследователям, которые проанализировали с помощью нейронных сетей метагеномы грибов, бактерий и архей, геолокация удалась несколько лучше, чем тем, кто ориентировался на пыльцу [12]. Они взяли образцы пыли, собранной волонтёрами в рамках проекта Wild life of our homes  (волонтёры собирали пыль с верхнего наличника внешней двери своего дома — а может, и чужого). На сей раз для половины из 1300 пыльных образцов, собранных в США, предсказанное расположение отличалось от настоящего менее чем на 100 километров. Когда тот же метод опробовали на пыли, собранной в разных странах, то оказалось, что для определения страны с точностью 90% достаточно одних грибов (точнее, метабаркодирования грибов).

Конечно, для геолокации по микробиомам необходимы постоянно обновляющиеся микробиомные карты, аналогичные картам распространения флоры, таким как BISON или iNaturalist. Зачатки таких карт уже существуют: например, проект MetaSUB c 2013 года собирает городские микробиомы по всему земному шару [13]. И хотя метод геолокации с помощью метабаркодирования ещё не получил широкого распространения, надеемся, что однажды карманные секвенаторы станут доступнее смартфонов, — и тогда вы сможете отследить по микробиому весь путь, который прошли кофейные зёрна, прежде чем добраться до вашей кофемолки.

Источники

1. Mildenhall D. Civil and criminal investigations. The use of spores and pollen [Электронный ресурс ] // SIAK-Journal − Zeitschrift für Polizeiwissenschaft und polizeiliche Praxis. 2008. № 4. Pp. 35-52. DOI: 10.7396/2008_4_E. URL: http://dx.doi.org/10.7396/2008_4_E (дата обращения 11.04.2024).
2. Suchan T., Talavera G., Sáez L., Ronikier M., Vila R. Pollen metabarcoding as a tool for tracking long-distance insect migrations [Электронный ресурс ] // Mol Ecol Resour. 2019. № 19. Pp. 149–162. DOI: 10.1111/1755-0998.12948. URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1755-0998.12948 (дата обращения 11.04.2024).
3. Goodman F. J. et al. PIGLT: A Pollen Identification and Geolocation system for forensic applications [Электронный ресурс ] // 2015 IEEE International Symposium on Technologies for Homeland Security (HST). Waltham, MA, USA, 2015. Pp. 1-7. DOI: 10.1109/THS.2015.7225271. URL: https://ieeexplore.ieee.org/document/7225271 (дата обращения 11.04.2024).
4. Hesse M., Halbritter H., Heigl H., Auer W. 2021. Salix caprea. In: PalDat — A palynological database. https://www.paldat.org/pub/Salix_caprea/306378; accessed 2024-04-22.
5. Halbritter H., Sam S., Weber M., Auer W. 2020. Alnus glutinosa. In: PalDat — A palynological database. https://www.paldat.org/pub/Alnus_glutinosa/303762; accessed 2024-04-22.
6. Halbritter H. 2016. Picea abies. In: PalDat — A palynological database. https://www.paldat.org/pub/Picea_abies/302357; accessed 2024-04-22.
7. Halbritter H., Sam S., Heigl H. 2020. Syringa vulgaris. In: PalDat — A palynological database. https://www.paldat.org/pub/Syringa_vulgaris/304333; accessed 2024-04-22.
8. Zhang J., Yu D., Wang Y., Shi L., Wang T., Simayijiang H., Yan J. Tracing recent outdoor geolocation by analyzing microbiota from shoe soles and shoeprints even after indoor walking [Электронный ресурс ] // Forensic Science International: Genetics. 2023. Volume 65. DOI: 10.1016/j.fsigen.2023.102869. URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1872497323000443 (дата обращения 11.04.2024).
9. He Y., Wu W., Zheng H. M. et al. Regional variation limits applications of healthy gut microbiome reference ranges and disease models [Электронный ресурс ] // Nat Med. 2018. № 24. Pp. 1532–1535. DOI: 10.1038/s41591-018-0164-x. URL: https://www.nature.com/articles/s41591-018-0164-x (дата обращения 11.04.2024).
10. Chen Q., Liu M., Xu C. et al. Potential of plant DNA information in determining the provenance and identify of unknown victims [Электронный ресурс ] // Forensic Science International. 2023. Volume 350. DOI: https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2023.111786. URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0379073823002360?via%3Dihub (дата обращения 11.04.2024).
11. Lennartz C., Kurucar J., Coppola S. et al. Geographic source estimation using airborne plant environmental DNA in dust [Электронный ресурс ] // Scientific Reports. 2021. № 11. DOI: 10.1038/s41598-021-95702-3. URL: https://www.nature.com/articles/s41598-021-95702-3 (дата обращения 11.04.2024).
12. Neal S. Grantham, Brian J. et al. Global Forensic Geolocation with Deep Neural Networks [Электронный ресурс ] // Journal of the Royal Statistical Society Series C: Applied Statistics, August 2020, Volume 69, Issue 4, Pp. 909–929. DOI: doi.org/10.1111/rssc.12427.
13. Danko D, et al. A global metagenomic map of urban microbiomes and antimicrobial resistance. [Электронный ресурс ] // Cell. 2021;184:3376–3393.e17. DOI: 10.1016/j.cell.2021.05.002.